姜黄素通过LOC769044/miR-1679/STAT1轴减轻黄曲霉毒素B1诱导的鸡肝坏死性凋亡

近日，一项来自东北农业大学和浙江农林大学的研究团队在国际知名期刊《Poultry Science》上发表了一项重要发现，揭示了姜黄素如何通过LOC769044/miR-1679/STAT1轴减轻黄曲霉毒素B1（AFB1）诱导的鸡肝细胞坏死性凋亡（necroptosis）。这一研究成果不仅为理解AFB1的毒性机制提供了新的视角，还为开发抗AFB1毒性的新策略提供了科学依据。本文将深入剖析这项研究，并特别介绍在研究过程中使用的AbMole产品，为读者呈现这一科学发现的生动图景。

研究背景

AFB1是一种广泛存在于霉变花生、大豆等农产品中的真菌毒素，具有强致癌性，对人和动物的健康构成严重威胁。在畜牧业中，AFB1污染的饲料会导致家禽生产性能下降、免疫力下降、发病率和死亡率增加，严重影响畜牧业的发展。此外，AFB1还会通过食物链对人类健康造成潜在威胁。因此，探索AFB1的毒性机制并寻找有效的解毒策略具有重要意义。

坏死性凋亡是一种独特的细胞死亡方式，与某些急性和慢性肝损伤密切相关。研究表明，AFB1可以诱导肝细胞发生坏死性凋亡，但其具体机制尚不完全清楚。姜黄素是一种从姜黄根茎中提取的天然酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。近年来，姜黄素在保护肝细胞免受损伤方面的研究备受关注。然而，关于姜黄素如何减轻AFB1诱导的肝细胞坏死性凋亡的机制尚待深入探索。

研究方法与实验过程

实验设计

研究团队设计了四组实验：对照组（正常饮食）、AFB1组（喂食含1mg/kg AFB1的饲料）、AFB1+姜黄素组（喂食含1mg/kg AFB1和300mg/kg姜黄素的饲料）以及姜黄素组（仅喂食300mg/kg姜黄素）。所有组别的鸡均有自由采食和饮水，实验周期为28天。

电子显微镜检查

实验结束后，研究团队首先通过电子显微镜观察了各组鸡肝细胞的超微结构变化。结果显示，对照组和姜黄素组肝细胞结构完整，线粒体清晰；而AFB1组肝细胞则表现出明显的坏死特征，如核形态异常、核膜破裂、线粒体肿胀等；AFB1+姜黄素组肝细胞结构则有所恢复。

RNA测序与数据分析

为了深入探讨姜黄素减轻AFB1毒性的分子机制，研究团队对鸡肝组织进行了RNA测序。通过Sangon Biotech公司的服务，他们获得了lncRNA和mRNA的转录组数据，并利用DEGseq算法识别了差异表达的lncRNAs和mRNAs（DELs和DEMs）。随后，他们利用RegRNA2.0和miRDB数据库预测了可能与这些差异表达lncRNAs结合的miRNAs，并通过RNAhybrid软件计算了结合位点的最小自由能（mfe），筛选出mfe≤-20kcal/mol的miRNAs作为最终目标基因。接着，他们利用miRDB数据库预测了这些miRNAs可能结合的mRNAs，并与差异表达的mRNAs取交集，确定了最终的靶mRNAs。最后，他们利用RAWGraphs2.0beta绘制了lncRNA-miRNA-mRNA网络图。

细胞培养与转染

为了进一步研究姜黄素对肝细胞坏死性凋亡的影响，研究团队采用了LMH细胞系（一种鸡肝癌细胞系）。他们首先将LMH细胞培养在DMEM培养基中，并在不同浓度的AFB1、姜黄素或坏死性凋亡抑制剂（nec-1）中处理12小时，然后利用CCK8试剂盒检测细胞活力。结果显示，AFB1显著降低了细胞活力，而姜黄素和nec-1则能有效缓解AFB1的毒性作用。

接着，研究团队利用GenePharma公司设计的LOC769044 siRNA、STAT1 siRNA和miR-1679 mimics对LMH细胞进行了转染。转染后，他们再次用AFB1、姜黄素或nec-1处理细胞，并收集细胞进行后续实验。

双荧光素酶报告基因检测

为了验证LOC769044和STAT1是否为miR-1679的直接靶基因，研究团队设计了包含miR-1679结合位点的LOC769044/STAT1片段及其突变序列，并构建了野生型和突变型重组质粒。然后，他们将这些质粒与miR-1679 mimics或NC共转染到LMH细胞中，并利用Dual-Lumi试剂盒检测了荧光素酶活性。结果显示，野生型LOC769044和STAT1质粒与miR-1679 mimics共转染后荧光素酶活性显著降低，而突变型质粒则无此变化，表明LOC769044和STAT1均为miR-1679的直接靶基因。

Annexin V-FITC/PI染色检测

为了评估AFB1、姜黄素和nec-1对肝细胞坏死性凋亡的影响，研究团队还进行了Annexin V-FITC/PI染色检测。结果显示，AFB1处理显著增加了坏死细胞的比例，而姜黄素和nec-1则能显著减少坏死细胞的数量。

生化分析与ATPase活性检测

此外，研究团队还检测了各组肝细胞中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性以及ATP酶的活性。结果显示，AFB1处理显著提高了ALT和AST的活性并降低了ATP酶的活性，而姜黄素则能有效逆转这些变化。

ELISA检测炎症因子和ROS水平

为了探讨姜黄素对肝细胞炎症反应的影响，研究团队还利用ELISA试剂盒检测了各组肝细胞中炎症因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS）以及活性氧（ROS）的水平。结果显示，AFB1处理显著提高了炎症因子和ROS的水平，而姜黄素则能有效降低这些指标的水平。

核质分离与qPCR分析

为了进一步研究LOC769044在肝细胞坏死性凋亡中的作用，研究团队还进行了核质分离实验并利用qPCR检测了LOC769044在细胞质和细胞核中的表达情况。结果显示，LOC769044主要定位于细胞质中，并在AFB1处理后显著上调，而在AFB1+姜黄素组中则有所下调。

Western Blotting分析

最后，研究团队还利用Western Blotting技术检测了各组肝细胞中坏死性凋亡相关蛋白（如RIPK1、RIPK3和MLKL）以及STAT1蛋白的表达情况。结果显示，AFB1处理显著上调了这些蛋白的表达水平，而姜黄素则能有效降低它们的表达水平。

实验结果分析

通过上述一系列实验，研究团队得出了以下结论：

1. 姜黄素能显著减轻AFB1诱导的鸡肝细胞坏死性凋亡：电子显微镜观察结果显示，姜黄素处理后的肝细胞结构有所恢复；细胞活力检测结果显示，姜黄素能有效缓解AFB1对肝细胞的毒性作用；Annexin V-FITC/PI染色检测结果显示，姜黄素能显著减少坏死细胞的比例。

2. LOC769044作为ceRNA与miR-1679结合并调控其下游靶基因STAT1的表达：RNA测序与数据分析结果显示，LOC769044在AFB1处理后显著上调，并在姜黄素处理后下调；双荧光素酶报告基因检测结果显示，LOC769044和STAT1均为miR-1679的直接靶基因；qPCR和Western Blotting分析结果显示，LOC769044与miR-1679呈负相关关系，而与STAT1呈正相关关系。

3. 姜黄素通过调控LOC769044/miR-1679/STAT1轴减轻AFB1诱导的肝细胞坏死性凋亡：过表达miR-1679或沉默LOC769044和STAT1均能显著减轻AFB1诱导的肝细胞坏死性凋亡；而姜黄素处理则能显著降低LOC769044和STAT1的表达水平并上调miR-1679的表达水平。

研究意义与未来展望

这项研究不仅揭示了姜黄素减轻AFB1诱导的肝细胞坏死性凋亡的新机制，还为开发抗AFB1毒性的新策略提供了科学依据。通过深入研究LOC769044/miR-1679/STAT1轴在肝细胞坏死性凋亡中的作用，研究团队为理解肝细胞坏死性凋亡的调控机制提供了新的视角。

未来，研究团队将继续探索姜黄素在其他细胞类型和组织中的抗凋亡作用及其分子机制。同时，他们还将进一步挖掘LOC769044/miR-1679/STAT1轴在肝细胞坏死性凋亡中的具体作用机制，并尝试开发基于这一轴的新型抗凋亡药物或干预策略。此外，随着高通量测序技术和生物信息学的发展，研究团队还将利用这些工具更深入地探索肝细胞坏死性凋亡的调控网络，为抗凋亡药物的开发提供更多理论依据和实验支持。

在研究过程中，研究团队使用了AbMole公司的CCK8试剂盒和Annexin V-FITC/PI试剂盒。CCK8试剂盒是一种快速、简便的细胞活力检测方法，能够准确反映细胞数量和活性；而Annexin V-FITC/PI试剂盒则能够高灵敏度地检测细胞凋亡的发生。这些产品的使用不仅提高了研究的准确性和可靠性，还为研究团队节省了大量时间和精力。

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 (Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit) | AbMole