Specally的博客

Jiang等利用TurboID研究了猪链球菌分泌的毒力蛋白SLY与宿主细胞表面蛋白的相互作用，发现SLY可与ARF6和PNN等宿主蛋白相互作用，并揭示了ARF6在SLY诱导的细胞毒性等过程中的作用。Ward等通过BioID技术研究了艰难梭菌毒素B（TcdB）与宿主细胞表面及细胞内因子的相互作用，利用重组蛋白与TurboID的融合蛋白，鉴定了多个候选相互作用蛋白，包括已知的受体如LRP1和FZD2等。在沙门氏菌效应蛋白的研究中，BioID技术成功鉴定了多个已知和新的宿主相互作用蛋白。

此外，该技术操作简便，生物素化蛋白易于纯化，且在瞬时表达系统中表现高效，可应用于多种植物组织和物种，无需依赖转基因植物。例如，在研究植物亚细胞区域蛋白质组时，TurboID能够高效捕获特定区域的蛋白质，为理解细胞器功能和相互作用提供重要信息。随着技术的不断优化和创新，TurboID及其衍生技术有望在植物生物学研究中发挥更大作用，助力科学家深入探索植物细胞的奥秘，为农业生物技术的发展提供新的理论基础和实践指导。TurboID技术的出现，为植物研究蛋白带来了新的突破，成为研究蛋白质相互作用和定位的有力工具。

PL技术的出现为这一领域带来了转机，先前的研究表明，APEX技术通过将APEX2酶靶向特定细胞区域，在H2O2和生物素标记的苯酚作用下，产生活性中间体，成功标记邻近的蛋白和RNA，帮助绘制出RNA在细胞内的分布图谱及其与蛋白的相互作用网络。另一方面，基于细胞表面糖链的标记方法，如将APEX2与糖链结合蛋白融合，或通过代谢引入含叠氮基的唾液酸标记细胞表面蛋白，为探究细胞间通信和细胞表面动态变化提供了有力工具，揭示细胞如何感知外界环境并做出响应。蛋白质在细胞内的运输过程对于细胞功能的正常发挥至关重要。

然而，传统的研究方法如免疫沉淀（IP-MS）和亲和纯化-质谱法（AP-MS）往往存在局限性，难以捕捉到弱或瞬时的蛋白质相互作用，尤其是涉及膜相关受体的相互作用。未来，随着技术的不断发展和改进，邻近标记技术有望在癌症研究中发挥更大的作用，特别是在揭示受体信号机制、改善靶向治疗以及克服药物抗性方面。我们期待该技术能够为癌症的精准治疗和个体化医疗提供更多的创新解决方案。该技术能够在活细胞的天然环境中捕捉蛋白质相互作用，包括弱或瞬时的相互作用，提供高分辨率的空间信息，并能够在体内和体外模型系统中应用。

从早期的APEX到如今的多种衍生技术，每一次改进都为研究提供了更强大的功能和更广阔的视野，其原理和操作步骤的阐述，让我们清晰地了解到这一技术如何精准地捕捉蛋白质的邻近信息，为揭示蛋白质相互作用和细胞内复杂网络提供了独特手段。基于过氧化物酶的邻近标记技术的原理是将过氧化物酶与目标蛋白融合表达，在过氧化氢存在的情况下，过氧化物酶能够催化生物素-酚等底物形成自由基，这些自由基具有高反应活性，可与标记半径内的邻近蛋白质的特定氨基酸残基反应，形成共价加合物，从而实现对邻近蛋白质的标记。基于过氧化物酶的邻近标记原理。

同时，随着对TurboID技术的深入研究和应用，我们期待它能够在更多的细胞器和细胞外环境中发挥作用，为揭示细胞内的蛋白质相互作用网络和生命活动的奥秘提供更加强大的技术支持。在活细胞内，TurboID能利用ATP将生物素转化为高反应活性的生物素-5'-AMP中间体，该中间体可与目标蛋白邻近的蛋白质上的赖氨酸残基发生共价结合，实现对邻近蛋白的生物素化标记，进而在短时间内高效捕获蛋白质相互作用网络。应运而生，这是一种经过定向进化的BioID变体，能够在更短的时间内完成生物素标记，并且在较低温度下也能有效工作。

随后，利用链霉亲和素的高亲和力，可以将生物素标记的蛋白质纯化出来，并通过质谱分析鉴定这些蛋白质，从而揭示目标蛋白的潜在相互作用伙伴。由于标记过程是在活细胞中进行的，通过分析被标记蛋白质的分布，可以推断目标蛋白在细胞中的位置以及其在不同生理状态下的定位变化。同时，需要设置适当的对照组，包括野生型细胞、BirA单独表达的细胞以及具有特定细胞定位信号的BirA表达细胞等，以排除非特异性标记和背景噪声的干扰。经过一系列严格的洗涤步骤去除未结合的蛋白质后，使用适当的洗脱条件将标记的蛋白质从磁珠上洗脱下来。

热蛋白质组分析（Thermal Proteome Profiling，TPP）是一种新兴的基于质谱（MS）的蛋白质组学技术，与细胞热位移分析（CETSA）相结合，通过检测蛋白质热稳定性的变化来研究蛋白质与配体的相互作用以及蛋白质的翻译后修饰。其次，精确的温度控制是实验成功的关键因素之一，因为温度的微小波动可能会影响蛋白质的热稳定性。TPP技术无需对蛋白质进行化学修饰，能够以天然形式捕获小分子的目标蛋白，这一特性避免了化学修饰可能带来的蛋白质结合亲和力改变的问题，确保了实验结果的准确性和可靠性。

分析物与配体结合时，传感器表面折射率改变，转换为SPR信号并以共振单位（RUs）量化，通过监测SPR信号变化，可获分子结合动力学和亲和力信息。随着科技的不断进步，SPR 技术在生物医学研究范畴内的应用前景愈发广阔，其在蛋白质—蛋白质、DNA—蛋白质以及抗体—抗原等各类相互作用研究中的广泛深度应用，清晰地彰显了其对药物研发和疾病治疗策略创新的强大推动力，可以说，SPR 技术已然成为生物医学研究领域一颗闪耀且具有无限潜能的明星，持续推动着该领域的蓬勃发展。监测SPR信号变化，记录结合和解离过程。

无需对蛋白质进行荧光标记等预处理，可在分子相互作用的自然状态下，实时记录结合和解离的动态过程，提供完整的动力学信息，包括结合速率常数（k_on）、解离速率常数（k_off）以及平衡解离常数（K_D），从而准确评估蛋白质间的亲和力和相互作用机制。3.结果与分析：SPR技术测得的酶—底物结合动力学参数显示，在某一特定酶促反应体系中，底物与酶的结合速率较快且亲和力适中，为后续深入研究该酶的催化循环过程以及筛选具有更高抑制活性的小分子化合物提供了精确的定量数据，加速了药物研发进程。

这些技术各具特色，从捕获稳定和瞬时相互作用的AP-MS，到解析动态相互作用的PL-MS，再到提供结构信息的LiP-MS和TPP，它们为研究天然免疫系统中的PPIs提供了多样化的工具。该方法通过将目标蛋白与标记酶融合，在激活酶后产生短寿命的自由基，与邻近蛋白质形成共价键，然后通过链霉亲和素亲和纯化和质谱分析鉴定标记的蛋白质。近年来，基于质谱（MS）的技术已成为研究 PPIs 的有力工具，凭借其卓越的灵敏度和特异性，这些方法能够系统性地解析蛋白质复合物，并在复杂的信号转导网络中揭示相互作用的对应关系。

未来，随着TPP技术的不断发展和完善，其在癌症治疗中的应用前景将更加广阔，有望为癌症患者带来更加有效的治疗方案和更高的生存率。例如，通过监测抗癌药物处理后相关蛋白的热稳定性变化，TPP能够揭示药物与靶点的直接相互作用，为新型抗癌药物的开发提供关键靶点信息。例如，研究通过TPP技术成功筛选出HnRNP A2/B1作为雷公藤内酯（Triptolide, TP）抗肿瘤作用的潜在直接靶点，不仅揭示了TP的多靶点协同机制，还为天然产物药物靶点的快速筛选提供了新的技术手段。

是一种创新的生物物理技术，它基于蛋白质在加热时的热稳定性变化，揭示蛋白质相互作用的动态网络。TPP的独特之处在于，它不仅能够检测稳定的蛋白质复合物，还能捕捉传统方法难以发现的瞬时和弱相互作用。例如，在研究热休克蛋白（HSP90）的客户蛋白网络时，TPP成功揭示了这些瞬时相互作用的动态特性，为理解蛋白质折叠和细胞应激反应提供了全新视角。例如，在病毒-宿主相互作用研究中，TPP技术帮助研究人员深入理解病毒如何通过改变宿主蛋白质的热稳定性来调控感染过程，为抗病毒药物的开发提供了新的靶点。则是细胞功能调控的基石。

LiP-MS技术不仅在蛋白质与聚合物的相互作用研究中表现出色，还能够轻松拓展至蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等更广泛的相互作用研究领域。展望未来，随着LiP-MS技术的持续进步与创新，我们有充分的理由相信，这一领域将迎来更多的突破与惊喜，为生物医学研究带来更为广阔的前景。然而，这些聚合物与蛋白质的相互作用机制尚不完全清楚。通过LiP-MS精确分析聚合物与蛋白质结合后的结构变化，该研究在研究干扰素α2a（IFN-α2a）与不同聚合物的相互作用时，LiP-MS揭示了聚合物在蛋白质表面的结合位点和结合强度。

IP-MS是研究蛋白质相互作用的一种常用技术，其核心原理基于抗原与抗体的特异性结合。IP效果评估产品基于样品中全蛋白和诱饵蛋白的质谱鉴定和定量数据评估IP实验成效，判断该样品是否满足进行互作蛋白筛选或动态互作组学的要求，在前期实验不理想的情况下尽快止损，并提供实验优化意见，以获得可靠和理想的IP-MS实验结果。动态互作组学产品通过不同条件下多个实验组样品与对照组样品间蛋白定量的差异，筛选出诱饵蛋白的相互作用蛋白，基于诱饵蛋白定量信息校正蛋白相互作用程度，并分析不同条件下蛋白相互作用程度的变化。

接下来，我将详细介绍LiP-MS技术在研究体内蛋白质变化中的应用方法，包括样本处理、实验设计、数据分析和结果解读等关键步骤，以期为相关领域的研究者提供参考和帮助。衰老是一个复杂的生物学过程，伴随着蛋白质组的多层次改变，包括蛋白质丰度的变化、翻译后修饰的积累以及蛋白质结构的改变。脑脊液（CSF）中含有与阿尔茨海默病相关的蛋白质形式和复合物，因此，研究CSF蛋白质的丰度和结构变化有望为理解衰老和神经退行性疾病提供新的见解。例如，在衰老的肌肉组织中，肌动蛋白和肌球蛋白的结构变化可能导致肌肉功能的衰退。

研究表明，LiP-MS技术在复杂细胞环境中展现出卓越的应用价值：它不仅能够系统性筛选结构特异性的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），还可高效验证已知的PPIs，并精确定位相互作用界面，为解析蛋白质在天然状态下的结构和功能关系提供了强有力的工具。然而，传统研究PPIs的技术手段，如免疫共沉淀（Co-IP）和酵母双杂交（Y2H）等，在解析结构特异性相互作用方面存在显著局限性：难以捕捉瞬态相互作用事件，无法有效识别特定蛋白质构象下的相互作用界面，这极大地限制了对疾病相关蛋白质分子机制的深入理解。

由于代谢物或小分子药物与蛋白质的结合可能导致蛋白质构象的改变，这种构象变化会影响蛋白酶的切割位点可及性，从而在有限的蛋白酶解过程中产生靶蛋白的特异性片段。通过上述分析流程，LiP-MS 能够系统性地识别和验证蛋白质-代谢物或蛋白质-药物的相互作用，为药物靶点发现和代谢调控研究提供了可靠的数据支持。作为一种强大的结构蛋白质组学方法，LiP-MS不仅能够在天然状态下高效检测蛋白质与小分子之间的相互作用，还能够在不依赖化学修饰的情况下精确识别结合位点，为复杂生物系统中的分子机制研究提供了全新的视角。

PBS清洗的主要目的是降低Beads样品中的非特异性结合背景蛋白，以及置换掉上一步与Beads一同孵育的细胞裂解液中的去垢剂（如NP40、TritonX-100等）。经过IP实验步骤或纯化富集的蛋白通常不超过10 μg，难以进行蛋白定量，因此IP-MS样品量通常以IP实验起始量作为衡量标准。，获得更多的蛋白鉴定和定量结果，筛选获得更多可能的相互作用蛋白，尤其是相互作用较弱、未被之前研究发现的相互作用蛋白。根据样品类型、起始细胞量和蛋白浓度的不同，细胞裂解液用量可进行相应调整。样品可在第③步完成后寄送。

在这28项研究中，10篇未在IP-MS中使用标签，10篇使用了Flag标签，5篇使用了GFP标签，其中有2项研究使用了2种不同标签分别进行IP-MS实验。本公司在近1年来（2023年7月至2024年7月）完成的IP-MS项目中有594项能够收集到标签相关信息，其中391个项目使用了蛋白亲和标签，Flag标签占265项，GFP标签59项，HA标签62项。理论上，抗体与诱饵蛋白的特异性结合并不一定需要特定的标签，但在实际研究中，受限于诱饵蛋白的表达水平和抗体的有效性等因素，很多研究会在细胞或动物模型中表达。

2、WB是靶向的检测并且经过了抗体的多级放大，理论上比质谱非靶向性的检测灵敏度要更高，所以需要做质谱的IP实验应该提高细胞量，高质量的IP-MS文章通常使用1e8（约10 cm dish x 10或15 cm dish x 5）的细胞起始用量。通过一次IP-MS实验，能高通量的鉴定和筛选到多个与要研究的目的蛋白（target）存在相互作用的蛋白质（蛋白质复合物组分），从而拥有属于自己的专属蛋白质相互作用数据库，能够进行更深入的生物学功能和分子机制的研究。在磁力架上静置1 min分离磁珠，去掉上清溶液；

而对于相对弱小的实验室，在前期方法学和重复上不舍得投入，有时候甚至在一个质量较差的数据上投入了大量的经费和时间去验证而没有意识到问题，为避免这种情况发生，我们的IP-MS数据报告第一个板块就是针对数据质量做评估，让研究者对本批次数据有一个准确的认识，是否需要优化，风险点在哪里？总之我们推荐老师在进行正式实验前应对IP实验的效率进行评估，通常的做法是进行跑胶考染，效果优秀的胶图应该是IP泳道和对照泳道均有数量众多、清晰的条带，并且泳道间总体一致的同时存在少量差异带条，目的带条差异尤为明显。

我们推出“IP效果评估”产品，基于样品中全蛋白和诱饵蛋白的质谱鉴定和定量数据评估IP实验成效，判断该样品是否满足进行互作蛋白筛选或动态互作组学的要求，在前期实验不理想的情况下尽快止损，并提供实验优化意见，以获得可靠和理想的IP-MS实验结果。我们推出的“互作蛋白筛选”产品，根据实验组与对照组样品间全蛋白的定量差异筛选高可信度互作蛋白，并结合STRING数据库中已知的互作蛋白，建立完整的蛋白互作网络，通过互作网络重要性评分和功能注释富集分析辅助选择更可能具有研究意义的关键互作蛋白。

白质之间的相互作用在几乎所有的生物学过程中都发挥着重要作用，研究蛋白质相互作用是理解许多生物学过程的基础。蛋白互作组学也是目前蛋白质组学研究的重要内容。为了研究蛋白-蛋白之间的相互作用，研究者们开发了许多研究方法。截至2021年底，在最大的蛋白互作数据库之一的Biogrid数据库中，共收录了来源于17种不同实验方法的145万多条蛋白互作信息。在Biogrid收录的这些研究方法中，Affinity Capture-MS，Proximity Label-MS和Co-fraction均为基于质谱的研究方法，这